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24th EHA Congress Travel Award 受賞レポート 橋本 一哉

更新日時:2019年11月1日

 

名前:橋本 一哉【京都大学iPS細胞研究所 江藤研究室】
発表日時:2019年6月14日
発表形式:Poster

Title:

Heterogeneity in epigenetically regulated LIN28A-Let-7a-5p-ROS axis leads to heterogeneity in megakaryocyte maturation

Authors:

Kazuya Hashimoto, Kosuke Fujio, Naoshi Sugimoto, Koji Eto

Affiliations:

Center for iPS cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan

Abstract:

Background: We have developed a robust ex vivo platelet like particle (PLP) generation system using self-renewing megakaryocyte (MK) cell lines, imMKCLs, which was established by introducing three doxycycline(DOX)-inducible transgenes, c-MYC, BMI1, and BCL-XL, into human induced pluripotent stem cell(iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) for extensive proliferation (Nakamura, et al. Cell Stem Cell 2014). This system is able to simply switch cell stages, since imMKCLs proliferate in the presence of DOX, and when DOX is removed, imMKCLs enlarge, form proplatelets and release PLPs. Recently we reported turbulence could dramatically improve the efficiency of PLP production from imMKCLs (Ito, et al. Cell 2018) and could manufacture adequate numbers of PLPs for each transfusion to patients. However, although imMKCLs display homogenous appearance at their proliferation stage, only a minor population eventually produces platelets at a level comparable to MKs in vivo

Aims: Elucidating the mechanism of the heterogeneity of imMKCL maturation and identifying a subpopulation of imMKCLs with high capacity to produce PLPs upon maturation.

Methods: We applied miRNA switch technology which could be used for detecting cell population subsets based on endogenous miRNA activity (Miki, et al. Cell Stem Cell 2015).

Results: We noticed that Let-7a-5p showed a distinguishable pattern with about 10% of the cells in the lower Let-7a-5p activity group (Group L), while other large majority in the higher activity group (Group H) already at the DOX present proliferation stage. Group L population revealed to produce significantly more PLPs than Group H population after DOX depletion. We then identified LIN28A, not LIN28B, was the upstream regulator of Let-7a-5p and its expression level was about 10-fold higher in Group L than Group H. We also examined HPCs differentiated from ES cells and confirmed there was heterogeneity in LIN28A expression.

Next we explored how the expression of LIN28A is regulated in imMKCLs. The CpG islands in LIN28A promoter region were significantly methylated in Group H cells and administration of pan histone deacetylase inhibitor, trichostatin A, upregulated the expression of LIN28A, suggesting LIN28A was regulated by the methylation of its promoter region in imMKCLs. 

Finally, we investigated the downstream target of LIN28A-Let-7a-5p in MK maturation and PLPs production. LIN28A is involved in cell metabolisms and ROS generation (Shyh-Chang, et al. Cell 2013), which is also reported to be important for MK maturation (Motohashi, et al. Blood 2010). In imMKCLs, Group L cells were found to produce more ROS than Group H cells using Flow Cytometry (MFI average 7926 vs 5334). By contrast, the expression of anti-oxidant genes NFE2L2 and NQO1, which prevent ROS accumulation, was downregulated in Group L according to RT-PCR.

Conclusion: We clarified that the heterogeneity of imMKCL maturation is caused by the heterogeneity in LIN28A-Let-7a-5p expression, which is already seemingly determined in HPC stage. Epigenetic regulation of LIN28A affects Let-7a-5p, further downstream ROS and eventually PLP generation in imMKCLs. By manipulating this pathway, we could resolve the heterogeneity of imMKCL maturation and dramatically improve PLPs production ability to realize commercialization of iPSC-derived platelet products.

EHA2019参加レポート

 この度は日本血液学会EHA Travel Awardに採択いただき,24th Congress of EHA参加の貴重な機会をいただきましたことに厚く御礼申し上げます。今回のEHAは6/13~17,オランダのアムステルダムで開催されましたが,アムステルダムは日本からの直行便が出ており,かつ学会会場が空港から電車ですぐ,という非常にアクセスの良い立地でした。滞在中少し雨が降ったこともありましたが,概ね良い気候の中,日本よりも涼しく快適に過ごすことができました。都会ではありながらも広い歩道や自転車道が完備され,また国全体でプラスチックバッグを使用しないなど環境に対する配慮が行われているあたり,さすがヨーロッパだと感じました。アムステルダム在住と思われる日本人も多く見かけられ,日本人にとっても住みやすい環境なのだろうと感じさせられました。

 私の発表は「巨核球成熟の不均一性」についてのものでした。特にLIN28Aという遺伝子に注目し,iPS細胞から分化した血液前駆細胞の段階でこの発現量には不均一性が生じており,その性質がそのまま巨核球・血小板の最終段階まで保持されて血小板産生能に影響を与える,という内容で発表いたしました。LIN28AはiPS細胞やES細胞といった多能性幹細胞に発現している遺伝子の一つとして最もよく知られた遺伝子であり,今後のiPS細胞を用いた血小板産生に大きくインパクトを与えうる研究として取り組んでいるものです。私の研究室からは昨年iPS細胞由来不死化巨核球株を用いた大量血小板産生についてCellに論文が掲載されており,そのインパクトもあってかポスター発表にもかかわらず多くの海外の研究者たちと有意義なディスカッションを行うことができました。やはり海外で他の研究者たちと議論をすると思わぬことに気づかされることも多く,帰国してからの自分の研究のモチベーションになるだけでなく,自分の領域からは外れることであってもしっかりアンテナを張って知識を仕入れることの重要さを痛感しました。

 他の研究発表については,2年前にASHに参加したときにも感じたことですが臨床研究の割合が高く基礎研究の割合が少し少なく感じました。また,ASHの時と比較してES/iPS細胞を利用した研究の割合が減っているようにも感じました。その分CAR-TやPD-1といった免疫療法の報告が増えているような印象を受けました。しかしやはりその中でもいくつかのグループが大量培養による血球作製等の発表を行っており,有意義な発見をすることができました。また私は臨床医として麻酔科の診療に従事しておりますが,「第XI因子欠乏症妊婦の脊椎・硬膜外麻酔」という報告も見つけ,一概に血液学会といっても幅広く研究がなされていることに感銘を受けました。。

 最後になりましたが,今回このような機会をいただきまして誠にありがとうございました。今回の素晴らしい経験を活かし,いろいろな方面からの視点を取り入れ,最新の知識をアップデートさせながら自分の研究をさらに推進させていく所存でございます。日本血液学会・国際委員会の先生方,日本血液学会事務局の皆様,いつもご指導いただいている江藤浩之教授をはじめとした先生方,研究を支えて下さいました皆様に心より御礼申し上げます。

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